Antikörper-Partikelkonjugate zur retadierten Freisetzung von Ektoparasitiziden

Die vorliegende Arbeit thematisiert die Biokonjugation von Antikörpern an

Mikropartikel, welche mit Flumethrin beladen sind. Die erhaltenen

Antikörper-Partikelkonjugate sind zur ektoparasitiziden Anwendung auf dem Fell von

Hunden bestimmt. Es werden Partikel von 1 - 2 µm Größe (d90-Wert der

Volumenverteilung) verwendet. Diese bestehen aus dem nicht bioabbaubaren Polymer

Polystyrol und sind auf dem Fell aufgrund ihrer Größe nicht sichtbar. Die Partikel

wurden mittels Emulsion-Evaporation Verfahren, wie unter (B.4) beschrieben,

hergestellt. Zur Konjugation der Proteine sind die Partikel mit Carboxylgruppen

modifiziert. Die Anbindung der Proteine kann auf verschiedenen Wegen erfolgen,

wobei zwischen ungerichteten und gerichteten Anbindungsstrategien (A.1.2)

unterschieden werden kann. Insgesamt werden drei Synthesewege durchgeführt und

evaluiert. Die Carbodiimid-Synthese, eine ungerichtete Anbindung, wird vergleichend

mit der Polysaccharid-Synthese, welche eine gerichtete Anbindung ist, untersucht. Eine

Synthese über Thioetherbindungen, die ebenfalls zu einer gerichteten Anbindung führt,

wurde praktiziert, aber aufgrund von wenig aussichtsreichen Resultaten nicht weiter

verfolgt (C.3.2.2). Die Charakterisierung der AK-Partikelkonjugate wird auf zwei

prinzipiell unterschiedlichen Wegen durchgeführt. Hierzu ist eine Unterteilung in eine

chemisch-physikalische und eine funktionelle Analytik zweckmäßig. Während

funktionelle Analysenverfahren die Bindungsfähigkeit von AK-Partikelkonjugaten

bewerten, weisen chemisch-physikalische Analysenverfahren (geänderte)

physikochemische Eigenschaften nach, ohne eine Aussage zu machen, ob das erhaltene

Konjugat die Funktionalität der Einzelkomponenten vereint.

Bei letzterem steht die Analytik mit spektroskopischen Methoden, nasschemischen

Nachweisen, sowie den physikalischen Eigenschaften der Partikel im Vordergrund. So

können durch Messungen des Zetapotentials unter Variation des pH-Wertes

Oberflächenmodifikationen im Verlauf von Aktivierungs- und Konjugationsreaktionen

mit Antikörpern im Detail nachvollzogen werden (C.2.1.1, C.2.2.1). Die einzelnen

Aktivierungsschritte der Carbodiimid-Synthese lassen sich mit dieser Methodik zeigen

und in Bezug auf ihre Reaktionsgeschwindigkeit charakterisieren. Auch Anbindungen

von Antikörper sind in einer Verschiebung des Zetapotentials zu größeren Werten zu

sehen. Dies ist durch das Vorhandensein von basischen funktionellen Gruppen der

Antikörper zu erklären. Weiterhin kann mittels Röntgenelektronen-Spektroskopie die

Anwesenheit von Proteinen auf den Mikropartikeln nachgewiesen werden. Hier zeigt

sich nach erfolgter Konjugation ein deutliches Signal von Elementen, wie Stickstoff,

Sauerstoff und Schwefel, welche in erhöhten Mengen in der Struktur des Antikörpers

vorkommen (C.2.2.2). Ein fluorimetrischer Nachweis von Antikörpern auf Partikeln

unter Verwendung von o-Phtaldialdehyd kann durchgeführt werden (C.2.1.3). Eine

Untersuchung der Anbindung von Antikörpern an Partikel ist zudem durch

Raster-Kraft-Mikroskopie möglich (C.2.2.3). Die Auflagerung der Antikörper verändert

hierbei das Profil der Partikeloberfläche gegenüber unmodifizierten Partikeln.

Um der Frage nach der Konjugations-Synthese mit der größtmöglichen

Bindungsaffinität nachzugehen, wird ein funktioneller Assay entwickelt, der auf

mehreren sequenziellen Filtrationsvorgängen beruht und die Menge an Flumethrin an

einer Haarprobe quantifiziert (C.1). Die Validität dieses Assays wird nach

ICH Guideline Q2(R1) für bioanalytische Verfahren untersucht und entspricht den

Anforderungen dieser Guideline. Mit der Methodik kann die Zunahme der

Bindungsaffinität von AK-Partikelkonjugaten gegenüber unkonjugierten Partikeln

gezeigt werden (C.2.2.4). Eine Inkubation der AK-Partikelkonjugate mit verschiedenen

denaturierenden Agenzien führt, wie erwartet, zu einem Bindungsabfall (C.1.9). Diese

Befunde sind elementar und unterstreichen die Validität des Assays. Werden Antikörper

in einer Orientierung an Partikel gebunden, in der die antigenbindenden Domänen von

der Oberfläche herausragen, wird von einer gerichteten Synthese gesprochen. Von

diesen AK-Partikelkonjugaten ist eine erhöhte Bindungsaffinität zu erwarten, da keine

sterische Behinderung der Antikörper-Antigen-Bindung besteht. Mit dem entwickelten

Assay gemessene Bindungen von AK-Partikelkonjugaten, die nach der gerichteten

Polysaccharid-Synthese erzeugt sind, sind den, mittels ungerichteter

Carbodiimid-Synthese generierten, Konjugaten überlegen (C.3.2). Diese Feststellung ist

zu erwarten und in Übereinstimmung mit der Literatur.

Ein Phänomen, welches bei verschiedenen Konjugations-Synthesen zu beobachten ist,

ist eine Agglomeration der erhaltenen AK-Partikelkonjugate. Es wird die Hypothese

formuliert, dass dies durch polyionische Wechselwirkungen von dissoziierbaren

funktionellen Gruppen auf den Partikeloberflächen nach der Konjugation zu begründen

ist. Berechnete Ladungsheterogenitäten lassen sich sehr gut mit experimentell

ermittelten Partikelgrößen korrelieren, die mittels Laserdiffraktometrie erhoben wurden

(C.3.3.2).

Eine klinische Untersuchung der Wirkung von flumethrinbeladenen

AK-Partikelkonjugaten gegenüber Zecken an Hunden und eine begleitende

HPLC-Analytik von Flumethrin aus Fellproben wurde, nach Validierung dieser,

durchgeführt (C.4). Die Wirksamkeit gegenüber Zecken ist in diesem Tierversuch

lediglich vergleichbar mit einer nichtretardierten Formulierung von Flumethrin. Eine

mögliche Ursache hierfür kann in einer verminderten Stabilität des Antikörpers auf

Fellproben bei erhöhten Lagertemperaturen gefunden werden (C.4.5).

Zusammenfassend kann in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Konjugation von

spezifischen Antikörpern gegen Hundehaar an flumethrinbeladene Mikropartikel

gelingt. Verschiedene analytische Methoden werden zur Charakterisierung der

AK-Partikelkonjugate herangezogen. Die Bindungsfähigkeit an Hundehaar kann in vitro

durch den Einsatz einer hierfür entwickelten, funktionellen analytischen Methode

gezeigt werden. Allerdings ist in Bezug auf die klinische Wirksamkeit gegenüber einer

nichtretardierten Darreichungsform keine verbesserte Wirkdauer festzustellen.